動物細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)

在所有的體外細胞培養(yǎng)中，動物細胞培養(yǎng)是最困難的。以下是它需要的特殊條件：

⑴血清：動物細胞的體外培養(yǎng)經(jīng)常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子，如激素、微量元素、礦物質(zhì)和脂肪。在這里，血清等于動物細胞體外培養(yǎng)的天然營養(yǎng)液。

⑵支持物：大多數(shù)動物細胞都有貼壁的習(xí)慣。體外培養(yǎng)常用玻璃塑料等作為支持。

⑶氣體交換：在細胞培養(yǎng)過程中要不斷調(diào)整二氧化碳和氧氣的比例，以維持所需的氣體條件。

植物細胞培養(yǎng)

⑴光照：體外培養(yǎng)的植物細胞對光照條件要求不高，因為細胞生長所需的物質(zhì)主要由培養(yǎng)基供給。然而，光不僅與光合作用有關(guān)，還與細胞分化有關(guān)例如，光周期可以調(diào)節(jié)性細胞分化和開花，因此在以獲得植株為目的的早期植物細胞培養(yǎng)過程中，光照條件尤為重要。通過植物細胞的體外培養(yǎng)獲得重要物質(zhì)如藥物的過程，其中大多數(shù)細胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)。

⑵激素：植物細胞的分裂和生長需要植物激素的調(diào)節(jié)，而促進細胞分裂的生長素和有絲分裂素是最基本的激素。植物細胞的分裂生長分化和個體生長周期受相應(yīng)的激素調(diào)控。相對于動物細胞，植物細胞體外培養(yǎng)的激素需求原理已經(jīng)了解，其應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，已經(jīng)有一套可用的培養(yǎng)基。同時解決了植物細胞對水敏感的問題、營養(yǎng)物、激素、滲透壓、酸堿度、對微量元素的需求等。

微生物細胞培養(yǎng)

微生物多為單細胞生物，野外生存條件較為簡單。因此，人工培養(yǎng)微生物的條件比動植物細胞簡單得多。其中厭氧微生物的培養(yǎng)比好氧微生物更復(fù)雜，因為嚴(yán)格厭氧需要維持二氧化碳等非氧惰性氣體的濃度，而好氧微生物只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣。微生物對培養(yǎng)條件的要求不如動植物細胞和玉米漿、蛋白胨、麥芽汁、酵母膏成為微生物良好的天然培養(yǎng)基。對于一些特殊微生物的營養(yǎng)需求，可以在這些天然培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加。

環(huán)境因素

1．無菌環(huán)境

無毒和無菌是細胞體外培養(yǎng)的首要條件。在體內(nèi)，解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可以抵御微生物或其他有害物質(zhì)的入侵，但在體外培養(yǎng)過程中，細胞缺乏免疫系統(tǒng)的保護，失去了對微生物的防御能力和對有害物質(zhì)的解毒能力。為了保證細胞能夠在體外生長繁殖，需要保證無菌的工作區(qū)域、良好的個人衛(wèi)生、無菌試劑培養(yǎng)基和無菌操作。

常見的微生物污染是支原體、細菌、真菌。支原體無致死毒性，可與細胞長期共存，對細胞有潛在影響，但體積小，不易鑒定，可通過地衣紅或Hoechst33342染色等方法檢測。細菌繁殖很快，可以在短時間內(nèi)放大，產(chǎn)生毒素殺死細胞。真菌種類很多，肉眼可見，漂浮在培養(yǎng)面上，可呈絲狀、管狀或樹枝狀等。

2.合適的溫度

一般哺乳動物和鳥類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度為37 ~ 38℃，不適宜的環(huán)境溫度會影響細胞的生長。細胞對低溫的耐受性強于對高溫的耐受性低溫下，細胞的代謝活性和有絲分裂能力下降。如果溫度不低于0℃，細胞代謝雖受影響，但無損傷；在25 ~ 35℃時，細胞生長緩慢；但是如果在40℃下放置幾個小時，不僅不利于細胞的存活、成長甚至?xí)?dǎo)致它的死亡。

3.適宜的滲透壓

高滲溶液或低滲溶液都會導(dǎo)致細胞折疊、腫脹、破裂。因此，滲透壓是細胞體外培養(yǎng)的重要條件之一。大多數(shù)體外培養(yǎng)的細胞對滲透壓都有一定的耐受力，在實際應(yīng)用中為260~320mmol/L的滲透壓適用于大多數(shù)細胞。

4．氣體環(huán)境與pH

體外細胞培養(yǎng)需要一個理想的氣體環(huán)境，氧氣、二氧化碳是細胞生存的必要條件。氧氣參與了細胞的活動細胞存活的三羧酸循環(huán)、新陳代謝和合成提供能量；二氧化碳不僅是細胞的代謝產(chǎn)物，也是細胞生長的必需成分，還與維持培養(yǎng)基的pH值有關(guān)。大多數(shù)細胞適宜的pH值范圍通常是7.2～7.4。在開放文化中，5%二氧化碳氣體的比例合適。

營養(yǎng)條件

1．培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)基含有細胞生長所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無機鹽、維生素等。根據(jù)不同細胞的營養(yǎng)需求，有許多合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。

2．其他添加成分

除了各種合成培養(yǎng)基提供的基本營養(yǎng)成分外，還需要根據(jù)不同的細胞和不同的培養(yǎng)目的添加血清等其他成分、因子等。

血清提供細胞外基質(zhì)、胎牛血清常用作生長因子轉(zhuǎn)鐵蛋白等重要物質(zhì)。血清的比例要根據(jù)不同的細胞和不同的研究目的來確定。10%～20%血清能維持細胞的快速生長和增殖，稱為生長培養(yǎng)基；為了維持細胞的緩慢生長或永生，加2%～5%血清可以稱為維持培養(yǎng)基。但血清中也有對細胞生長繁殖有害的物質(zhì)，如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子；成分不清影響結(jié)果分析；不同動物、不同批次的血清活性差異較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。

谷氨酰胺是細胞生長的重要氮源，在細胞生長和代謝過程中起著重要作用但由于谷氨酰胺不穩(wěn)定，在溶液中易降解，在4℃放置7天，可分解50左右%所以使用前要添加谷氨酰胺。