細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)（Cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、PH值和某些營(yíng)養(yǎng)條件），使之生存、生長(zhǎng)、一種復(fù)制和保持主要結(jié)構(gòu)和功能的方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，生物學(xué)上的正式術(shù)語(yǔ)是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。無(wú)論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)還是生物克隆技術(shù)之一，細(xì)胞培養(yǎng)都是必不可少的過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以將一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)大量培養(yǎng)后轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或分化很少的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié)，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中一項(xiàng)重要且常用的技術(shù)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，可以獲得大量的細(xì)胞，可以研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等。
種類(lèi)劃分
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)在所有的體外細(xì)胞培養(yǎng)中，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是最困難的。以下是它需要的特殊條件：
⑴血清：動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)經(jīng)常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生長(zhǎng)必需因子，如激素、微量元素、礦物質(zhì)和脂肪。在這里，血清等于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的天然營(yíng)養(yǎng)液。
⑵支持物：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都有貼壁的習(xí)慣。體外培養(yǎng)常用玻璃塑料等作為支持。
⑶氣體交換：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中要不斷調(diào)整二氧化碳和氧氣的比例，以維持所需的氣體條件。
植物細(xì)胞培養(yǎng)
⑴光照：體外培養(yǎng)的植物細(xì)胞對(duì)光照條件要求不高，因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)所需的物質(zhì)主要由培養(yǎng)基供給。然而，光不僅與光合作用有關(guān)，還與細(xì)胞分化有關(guān)例如，光周期可以調(diào)節(jié)性細(xì)胞分化和開(kāi)花，因此在以獲得植株為目的的早期植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，光照條件尤為重要。通過(guò)植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得重要物質(zhì)如藥物的過(guò)程，其中大多數(shù)細(xì)胞在反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)。
⑵激素：植物細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)需要植物激素的調(diào)節(jié)，而促進(jìn)細(xì)胞分裂的生長(zhǎng)素和有絲分裂素是最基本的激素。植物細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)分化和個(gè)體生長(zhǎng)周期受相應(yīng)的激素調(diào)控。相對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞體外培養(yǎng)的激素需求原理已經(jīng)了解，其應(yīng)用技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，已經(jīng)有一套可用的培養(yǎng)基。同時(shí)解決了植物細(xì)胞對(duì)水敏感的問(wèn)題、營(yíng)養(yǎng)物、激素、滲透壓、酸堿度、對(duì)微量元素的需求等。
微生物細(xì)胞培養(yǎng)
微生物多為單細(xì)胞生物，野外生存條件較為簡(jiǎn)單。因此，人工培養(yǎng)微生物的條件比動(dòng)植物細(xì)胞簡(jiǎn)單得多。其中厭氧微生物的培養(yǎng)比好氧微生物更復(fù)雜，因?yàn)閲?yán)格厭氧需要維持二氧化碳等非氧惰性氣體的濃度，而好氧微生物只需要通過(guò)不斷攪拌提供無(wú)菌氧氣。微生物對(duì)培養(yǎng)條件的要求不如動(dòng)植物細(xì)胞和玉米漿、蛋白胨、麥芽汁、酵母膏成為微生物良好的天然培養(yǎng)基。對(duì)于一些特殊微生物的營(yíng)養(yǎng)需求，可以在這些天然培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加。
環(huán)境條件
環(huán)境因素
1．無(wú)菌環(huán)境
無(wú)毒和無(wú)菌是細(xì)胞體外培養(yǎng)的首要條件。在體內(nèi)，解毒系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可以抵御微生物或其他有害物質(zhì)的入侵，但在體外培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞缺乏免疫系統(tǒng)的保護(hù)，失去了對(duì)微生物的防御能力和對(duì)有害物質(zhì)的解毒能力。為了保證細(xì)胞能夠在體外生長(zhǎng)繁殖，需要保證無(wú)菌的工作區(qū)域、良好的個(gè)人衛(wèi)生、無(wú)菌試劑培養(yǎng)基和無(wú)菌操作。
常見(jiàn)的微生物污染是支原體、細(xì)菌、真菌。支原體無(wú)致死毒性，可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存，對(duì)細(xì)胞有潛在影響，但體積小，不易鑒定，可通過(guò)地衣紅或Hoechst33342染色等方法檢測(cè)。細(xì)菌繁殖很快，可以在短時(shí)間內(nèi)放大，產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。真菌種類(lèi)很多，肉眼可見(jiàn)，漂浮在培養(yǎng)面上，可呈絲狀、管狀或樹(shù)枝狀等。
2.合適的溫度
一般哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度為37 ~ 38℃，不適宜的環(huán)境溫度會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性強(qiáng)于對(duì)高溫的耐受性低溫下，細(xì)胞的代謝活性和有絲分裂能力下降。如果溫度不低于0℃，細(xì)胞代謝雖受影響，但無(wú)損傷；在25 ~ 35℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；但是如果在40℃下放置幾個(gè)小時(shí)，不僅不利于細(xì)胞的存活、成長(zhǎng)甚至?xí)?dǎo)致它的死亡。
3.適宜的滲透壓
高滲溶液或低滲溶液都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞折疊、腫脹、破裂。因此，滲透壓是細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要條件之一。大多數(shù)體外培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)滲透壓都有一定的耐受力，在實(shí)際應(yīng)用中為260~320mmol/L的滲透壓適用于大多數(shù)細(xì)胞。
4．氣體環(huán)境與pH
體外細(xì)胞培養(yǎng)需要一個(gè)理想的氣體環(huán)境，氧氣、二氧化碳是細(xì)胞生存的必要條件。氧氣參與了細(xì)胞的活動(dòng)細(xì)胞存活的三羧酸循環(huán)、新陳代謝和合成提供能量；二氧化碳不僅是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)的必需成分，還與維持培養(yǎng)基的pH值有關(guān)。大多數(shù)細(xì)胞適宜的pH值范圍通常是7.2～7.4。在開(kāi)放文化中，5%二氧化碳?xì)怏w的比例合適。
營(yíng)養(yǎng)條件
1．培養(yǎng)基
細(xì)胞培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素等。根據(jù)不同細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，有許多合成培養(yǎng)基可供選擇，如EBSS、Eagle、MEM、RPMll640、DMEM等。
2．其他添加成分
除了各種合成培養(yǎng)基提供的基本營(yíng)養(yǎng)成分外，還需要根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的培養(yǎng)目的添加血清等其他成分、因子等。
血清提供細(xì)胞外基質(zhì)、胎牛血清常用作生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)鐵蛋白等重要物質(zhì)。血清的比例要根據(jù)不同的細(xì)胞和不同的研究目的來(lái)確定。10%～20%血清能維持細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和增殖，稱(chēng)為生長(zhǎng)培養(yǎng)基；為了維持細(xì)胞的緩慢生長(zhǎng)或永生，加2%～5%血清可以稱(chēng)為維持培養(yǎng)基。但血清中也有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖有害的物質(zhì)，如補(bǔ)體、免疫球蛋白和一些生長(zhǎng)抑制因子；成分不清影響結(jié)果分析；不同動(dòng)物、不同批次的血清活性差異較大，影響培養(yǎng)效果的穩(wěn)定性。
谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要氮源，在細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中起著重要作用但由于谷氨酰胺不穩(wěn)定，在溶液中易降解，在4℃放置7天，可分解50左右%所以使用前要添加谷氨酰胺。
設(shè)施器材
一般過(guò)程
